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因為使用方便、構建簡單，CRISPR 被認為是遺傳研究領域的革命性技術。 如今，這個 熱門基因編輯工具不僅被用於改造哺乳動物細胞，從農業到醫療甚至到環境保護（ 麻省理工教授張鋒： CRISPR 將在氣候問題上大放異彩 ），科學家們都對它表現出極濃的興趣。
而在 CRISPR 的研究上，有兩個先鋒人物我們不得不提，那就是麻省理工學院教授 張鋒 和加州大學伯克利分校教授 Jennifer Doudna 。
圖丨 張鋒和 Jennifer Doudna
Jennifer Doudna 早些年對CRISPR 系統做了許多基礎研究，2012 年發表於《Science》的文章中首次證實了CRISPR 在活細胞中修改基因的能力，並且完整地討論了CRISPR 在基因組編輯上的可能性 。 張鋒團隊則在 2013 年發表的文章中首次將 CRISPR 系統用於哺乳動物細胞的基因編輯。 就此，張鋒團隊率先在美國得到了知識產權的保護，然而，歐洲專利局卻撤銷了張鋒團隊的專利申請。 至今，兩位元老之間的專利之爭還在如火如荼地進行著。
巧合的是，2月15日的《Science》上發表的兩項研究分別展示了由 Jennifer Doudna 和張鋒實驗室基於 CRISPR 系統開發的全新診斷工具。
在其中一篇論文中，Doudna的團隊展現了一個名為DETECTR的系統， 它可以準確地識別人源樣本中不同類型的 HPV 病毒。 在另一篇論文中，張鋒團隊則展示了性能優化的 SHERLOCK 系統，該系統於去年開發成功， 用於檢測人源樣本中的寨卡病毒，登革熱病毒以及其他有害細菌。
這兩篇論文共同證明了 CRISPR 的巨大潛力，而不僅僅只用於基因組編輯。
“它使新一代診斷技術成為可能，並且比目前的技術更具成本效益 ” ， 羅切斯特大學生物化學和生物物理系的助理教授 Mitchell O’Connell 說。
Doudna 團 隊：100%準確檢測出 HPV 16 感染
在《Science》發表的研究中，Doudna 團隊使用的是 CRISPR-Cas12a 系統。 他們發現一個很有趣的現象：這種 CRISPR 系統在剪切靶向的雙鏈 DNA 的同時，Cas12 的 DNA 酶活性會被激活，而該酶能非特異性切割單鏈 DNA（ssDNA）。
該研究的共同作者，加州大學伯克利分校實驗室研究員 Janice Chen 對此表示：“ 這是一個意外但是很‘瘋狂’的發現 。 ”
圖丨 DETECT R 工作原理
之所以說這是一個“瘋狂”的發現， 是因為這個發現為細胞內檢測是否含有某目的DNA 提供了一個全新的思路： 同時向細胞內遞送靶向該DNA 的CRISPR-Cas12a 系統和非特異性ssDNA 熒光報告基因（FQ-labeled reporter），一旦檢測到目的DNA，CRISPR-Cas12a 系統將啟動，與此同時，熒光報告基因也會 被降解，從而釋放出熒光信號。
基於此，Chen和她的同事們開發了一種可用於診斷病毒感染的新型診斷工具，並通過與 等溫核酸擴增 技術的聯用提高了靈敏度。 該工具被命名為DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter，簡稱 DETECTR 。
到目前為止，科學家們已在試管水平證明 DETECTR 可以 100%準確地檢測出HPV16感染，92％準確地檢測出 HPV18 感染 。 HPV16 和 HPV18 能增加患者發生癌症的概率，是兩種特別危險的HPV 亞型。
“當然，我們還需要不斷改進該系統。但從原則上來說，這個想法是可行的，我們真的很興奮。”Chen說。
令人欣喜的是，相比於其他測試，DETECTR測試價格低廉且快捷： 單次成本不到一美元，只需一個小時 。
現在， Chen和她的團隊正在努力開發能輕鬆讀取熒光信號的硬件設備 。 他們還想測試系統是否能響應其他人源樣本，如血液，唾液或尿液。
張鋒團隊：靈敏度提高100倍，可檢測多種病毒
去年，張鋒團隊向公眾展示了 SHERLOCK 如何利用 CRISPR-Cas13a 在多種人類樣本（如唾液）中發現寨卡，登革熱的 RNA 序列，甚至一些與癌症突變相關的序列。
而今，SHERLOCKv2 誕生了。 與 SHERLOCK 相比，其靈敏度提高了100倍，並能在同一樣品中檢測出多種病毒感染，比如能 同時檢出寨卡 和登革熱病毒 。
之所以能達到這樣效果，是因為他們在 SHERLOCKv2 中引入了多種來自不同種屬細菌的 Cas13 酶，如 LwaCas13a 和 PsmCas13b。
圖丨 CRISPR-Cas13a
這些不同的 Cas 酶對不同的RNA序列表現出不同的“偏愛”程度。 換句話說，同時向細胞遞送多種酶和多種不同熒光的報告基因，一旦CRISPR 系統發現目的基因，對應的Cas13就會啟動剪切酶活性，剪切相應的熒光報告基因，從而釋放出熒光 信號。
這原理其實和 Doudna團隊的 DETECTR 基本一致，只不過張鋒團隊設計的熒光報告基因必須是特異性，而 Doudna 團隊則是非特異性的。 然而，也正是“特異性”這個優點使得 SHERLOCKv2 可以同時檢測多種序列。
同樣相似的思路是，為了提高靈敏度，張鋒團隊也引入了等溫核擴增技術。 但是除此之外，他們向體系中還引入了CRISPR type-III中的Csm6酶。 Csm6酶的特異性切割序列為環腺苷酸分子和末端為2’,3’-環磷酸的線性腺苷酸。 他們發現通過設計CRISPR系統使得Cas13剪切後的序列是Csm6酶的靶向序列，能大大提高靈敏度。
“這些放入一個管中的所有酶，它們不僅相互作用發揮了更好的作用，而且讓我們得到了珍貴的生物學信息。這真是太棒了，充分向我們展現了生物化學的強大力量” ， 論文的共同作者，來自張鋒實驗室的博士生 Jonathan Gootenberg說。
目前，病毒感染診斷一般包括病毒分離與鑑定、病毒核酸與抗原的直接檢出以及特異性抗體的檢測， 不僅耗時長，而且對醫療設備和操作人員的專業水準要求很高。 因此，如果能開發出一種不需依賴貴重設備和醫護人員的智能診斷設備顯得非常重要 ，尤其對於病毒感染經常肆意橫行的發展中國家。
而與 DETECTR 相比，張鋒團隊論文所描述的診斷工具SHERLOCKv2離這樣的目標更進一步。
圖 | SHERLOCK 試紙檢測結果展示
像 DETECTR 一樣， SHERLOCK 也使用熒光信號作為輸出。 但是不僅僅限於此，張鋒團隊還開發了類似於驗孕棒一樣的試紙檢測方法。 現在，不需要任何特殊設備， 只需一張試紙 ，SHERLOCKv2 就能顯示出病毒感染檢測結果，非常易於使用。
“試想一個很糟糕的情況，沒有任何能源如電力。然而只要有樣品，SHERLOCKv2 試紙就能在現場發揮作用” ， O’Connell 稱。 而且它也很便宜： SHERLOCKv2 試紙只需幾美元 。
雖然 DETECTR 和 SHERLOCK 已向我們展現出它們在診斷中的強大力量，但是在進入臨床使用前，研究者們仍有很多工作需要做以確保診斷的準確性。
不過，相信這些新診斷工具絕對將改寫未來的診斷技術，尤其將給那些缺乏先進設備和訓練有素的人員的發展中國家帶來很大不同。 “它有影響人類健康和全社會的真正潛力” ， 來自張鋒實驗室的另一位博士生、該論文的共同作者Omar Abudayyeh說。
總而言之，兩支團隊正在開發的這些基於CRISPR、用於快速診斷感染的便宜設備， 有望為全球，特別是發展中國家的病毒（如 HPV 和寨卡）感染診斷，帶來一場真正的革命 。
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校審：黃珊
參考：
https://www.broadinstitute.org/news/sherlock-team-advances-its-crispr-based-diagnostic-tool
http://news.berkeley.edu/2018/02/15/crispr-scissors-cas12a-enables-cutting-edge-diagnostics/
